产品分类
Strep-tag 纯化填料
- 产品描述
- 产品介绍
- 产品使用说明
- 其他说明
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- 品牌: ELEMok138cn太阳集团529
- 商品名称: Strep-tag 纯化填料
- 商品编号: LMMS04004
- 数量: 5ml
- 名称: Strep-tag 纯化填料
- 保存条件: 4℃ 20% 乙醇或者 4℃ 含有 0.5%Na₂N₂ 的 PBS 中
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Strep-tag 纯化填料是一种将 Strep 蛋白键合在琼脂糖凝胶微球上形成的生物亲和层析分离介质，主要用于纯化 Strep-tag 标签蛋白。Strep-tag 标签蛋白与凝胶结合后可使用脱硫生物素竞争方式进行洗脱，该洗脱方式比较温和， 一般不会影响蛋白质的性质。如蛋白质能耐受一定的碱，也可用碱液洗脱，比如 10mM NaOH 等。推荐采购ok138cn太阳集团529 EGFP-StrepII 标签蛋白（货号 LMMS04005）进行纯化填料的质控，及实验条件的摸索。
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1. 样品准备:
01.蛋白诱导表达:在细胞中表达 strep-tag标签蛋白。
02.用结合缓冲液重悬菌体，也可用超声裂解，注意样品结合缓冲液与平衡缓冲液相同。(如有需要可适当加入SPMF 蛋白酶抑制剂)。
2. 层析(以 1ml填料为例 )
01.取出 Strep-tag 纯化填料 1ml到 50 mL离心管，加5倍体积的结合缓冲液洗涤,3000g,离心5 min,弃上清,重复3 遍。将准备好的样品与平衡好的填料混合,室温下孵育 1h。
02. 填料装柱，收集流出液，记为“流穿”。
03. 用 6 mL 结合缓冲液洗填料。
04.用洗脱缓冲液(结合缓冲液 +2.5mM 脱硫生物素) 洗 2.5mL 记为第一管，2.5mL洗脱缓冲液洗第二遍记为第二管。可以增加洗脱体积,直至将全部蛋白洗脱。
05. 将样品原液、流穿液、洗脱液进行 SDS-page 实验。
06. NaOH 柱子再生：洗脱目的蛋白后的柱子用蒸馏水清洗 3-5 个 柱体积。
07. 用 0.5M NaOH 再生 3-5 个柱体积；再用蒸馏水清洗至中性， 用 20% 乙醇保存柱子。
08. HABA 再生：用脱硫生物素洗脱目的蛋白的，还可以用 HABA 缓冲液再生，一般用 HABA 的结合缓冲液洗 15 个柱体积，再用结合缓冲液洗 30 个柱体积，然后可以用 20% 乙醇保存柱子，或进行下一步纯化。HABA上柱后凝胶颜色会变为红橙色，在结合缓冲液平衡后会恢复正常的白色，这种再生方式一般使用体积会大些。
3. 缓冲液配置:
- 纯化 Strep II 标签蛋白 :
结合缓冲液：100mM Tris-HCl ，150mM NaCl ，1mM EDTA ， pH8.0； 或 20mM NaH2PO4，280mM NaCl， 6mM KCl ，pH7.4
洗脱缓冲液：结合 缓冲液 + 2.5mM 脱硫生物素；或 10mM NaOH
再生缓冲液：0.5M NaOH；或结合缓冲液 +1mM HABA
- 纯化 Strep-tag 标签蛋白：
结合缓冲液：100mM Tris-HCl ，150mM NaCl ，1mM EDTA ， pH8.0； 或 20mM NaH2PO4，280mM NaCl， 6mM KCl ，pH7.4洗脱缓冲液：结合缓冲液 +5mM 脱硫生物素；再生缓冲液：0.5M NaOH；或结合缓冲液 +1mM HABA
4. 目标蛋白检测及保存01. 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。02. 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
注意事项：- 样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；蛋白样品上样前，建议使用 0.45μm 过滤器过滤。
- 如果对蛋白纯度要求较高请勿重复使用填料，每 1ml Strep-tag 纯化填 料可以结合大于 3.5mg 融合蛋白。
- 如果融合蛋白是包涵体形式，那么只有做了复性以后，才可以使用 Strep-tag 纯化填料纯化，通常的复性过程耗时、耗力，并不容易成功。
- 结合缓冲液可以根据自身实验需要进行配置，但是使用前请进行小量纯化测试。
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常见问题解答：问题1.目的蛋白与树脂不结合或结合效率低解决方案与建议：01. 目的蛋白中没有 strep-Tag，测序确认，调整阅读框，使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌作为表达菌，使用蛋白酶抑制剂。02. strep-tag 融合蛋白被超声打断降解，建议使用细菌裂解液在室温温和裂解大肠杆菌，可完全裂解细菌，裂解液上清加入 2 倍体积的平衡缓冲液可直接上柱纯化。03. 结合条件不对，请检查结合缓冲液的 PH ，使用合适的结合缓冲液04. 填料使用次数太多，如果已经使用多次，应考虑再生或更换新的树脂问题2.蛋白不能洗脱或洗脱效率低解决方案与建议：01. 洗脱时流速过快，建议加入洗脱液后堵住流出口并轻微震荡使洗脱液与填料充分反应，或者轻微震荡。02. 裂解上清中 strep-tag 标签蛋白浓度太低：浓缩目的上清增加目的蛋白浓度，改变表达条件；如果使用strep-tag 标签可以换用 twin-strep-tag 标签以增加亲和力。03. 洗脱缓冲液的 pH 不对。04. strep-tag 融合蛋白已经发生降解在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂出现多条带可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，应选用蛋白酶缺陷型宿主菌（如 lon 或 ompT）。问题3.洗脱蛋白中有杂质解决方案与建议：01. 上样量过大，减少上样量或增加清洗体积，不是所有目的蛋白都是全长蛋白 , 如果 cDNA 含有稀有密码子应该使用 Rosetta 系列作为宿主菌。02. 超声处理过度 , 减少超声，避免发泡导致蛋白变性。建议使用细菌裂解液在室温温和裂解大肠杆菌，可完全裂解细菌，裂解液上清加入 2 倍体积的平衡缓冲液可直接上柱纯化。03. 共价共纯化胶上有些多出来的条带是共纯化的促进蛋白正确折叠的分子伴侣，如： DnaK (70kDa) ， DnaJ (37kDa) ， GrpE(40kDa) ， GroEL (57kDa)，和 GroES (10kDa)，再进行一次纯化可以改善。问题4.Strep-tag 标签蛋白清洗液中出现目的蛋白解决方案与建议：上清中蛋白浓度过高 , 减少上样量或增加清洗体积，当清洗体积过大时出现 Strep-tag 标签蛋白被洗脱下来，是正常现象
产品类型： Strep-tag 纯化填料
产品试剂清单
名称
Strep-tag 纯化填料
数量
5ml
保存条件
4℃ 20% 乙醇或者 4℃ 含有 0.5%Na₂N₂ 的 PBS 中
产品介绍
产品使用说明
1. 样品准备:
01.蛋白诱导表达:在细胞中表达 strep-tag标签蛋白。
02.用结合缓冲液重悬菌体，也可用超声裂解，注意样品结合缓冲液与平衡缓冲液相同。(如有需要可适当加入SPMF 蛋白酶抑制剂)。
2. 层析(以 1ml填料为例 )
01.取出 Strep-tag 纯化填料 1ml到 50 mL离心管，加5倍体积的结合缓冲液洗涤,3000g,离心5 min,弃上清,重复3 遍。将准备好的样品与平衡好的填料混合,室温下孵育 1h。
02. 填料装柱，收集流出液，记为“流穿”。
03. 用 6 mL 结合缓冲液洗填料。
04.用洗脱缓冲液(结合缓冲液 +2.5mM 脱硫生物素) 洗 2.5mL 记为第一管，2.5mL洗脱缓冲液洗第二遍记为第二管。可以增加洗脱体积,直至将全部蛋白洗脱。
05. 将样品原液、流穿液、洗脱液进行 SDS-page 实验。
06. NaOH 柱子再生：洗脱目的蛋白后的柱子用蒸馏水清洗 3-5 个 柱体积。
07. 用 0.5M NaOH 再生 3-5 个柱体积；再用蒸馏水清洗至中性， 用 20% 乙醇保存柱子。
08. HABA 再生：用脱硫生物素洗脱目的蛋白的，还可以用 HABA 缓冲液再生，一般用 HABA 的结合缓冲液洗 15 个柱体积，再用结合缓冲液洗 30 个柱体积，然后可以用 20% 乙醇保存柱子，或进行下一步纯化。HABA上柱后凝胶颜色会变为红橙色，在结合缓冲液平衡后会恢复正常的白色，这种再生方式一般使用体积会大些。
3. 缓冲液配置:
- 纯化 Strep II 标签蛋白 :
结合缓冲液：100mM Tris-HCl ，150mM NaCl ，1mM EDTA ， pH8.0； 或 20mM NaH2PO4，280mM NaCl， 6mM KCl ，pH7.4
洗脱缓冲液：结合 缓冲液 + 2.5mM 脱硫生物素；或 10mM NaOH
再生缓冲液：0.5M NaOH；或结合缓冲液 +1mM HABA
- 纯化 Strep-tag 标签蛋白：
再生缓冲液：0.5M NaOH；或结合缓冲液 +1mM HABA
02. 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
- 样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；蛋白样品上样前，建议使用 0.45μm 过滤器过滤。
- 如果对蛋白纯度要求较高请勿重复使用填料，每 1ml Strep-tag 纯化填 料可以结合大于 3.5mg 融合蛋白。
- 如果融合蛋白是包涵体形式，那么只有做了复性以后，才可以使用 Strep-tag 纯化填料纯化，通常的复性过程耗时、耗力，并不容易成功。
- 结合缓冲液可以根据自身实验需要进行配置，但是使用前请进行小量纯化测试。
其他说明