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技术专题 | 液-液相分离 (LLPS)：现代生物医学中的新前沿【珍藏】

2024-08-04

液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）是指在细胞内某些生物大分子（如蛋白质和RNA）通过相互作用，形成具有不同组分和性质的相分离液滴[1]。这些液滴类似于油滴在水中的分离状态，形成了细胞内的一种独特的亚结构。液-液相分离现象广泛存在于细胞核、细胞质和细胞器中，是许多细胞过程的重要组成部分。

一、液液相分离的生物学功能
1. 形成无膜细胞器
LLPS是形成无膜细胞器（membraneless organelles）的一种基本机制。这些无膜细胞器包括核仁、压力颗粒、Cajal小体、P-bodies等。它们没有由脂双层膜包围，但能够通过LLPS的机制将特定的蛋白质和核酸分子集中在一起。
2. 动态调控和快速响应
LLPS允许细胞快速、可逆地调控蛋白质和RNA的聚集与分散，这是细胞应对环境变化和信号传导的关键机制[2]。
3. 基因表达调控
LLPS对基因表达的调控具有重要作用。在RNA加工过程中，某些LLPS形成的无膜细胞器富含与RNA加工相关的蛋白质和因子，可以集中RNA编辑、剪接、降解等过程中的关键分子。在翻译过程中，通过形成翻译抑制或激活的微区，LLPS能够在翻译水平上调节特定mRNA的表达。
4. 代谢调控
细胞代谢中的某些反应需要通过LLPS机制来组织和优化。
5. 疾病发生
LLPS的异常往往与疾病相关，特别是在蛋白质聚集相关的疾病中，如神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）和某些类型的癌症。

二、相分离在肿瘤中的研究

1、相分离调控基因表达
研究人员发现在m6A阅读蛋白中，细胞核内m6A阅读蛋白YTHDC1对AML细胞生存尤为关键[3]。YTHDC1在多个不同亚型的AML病例样本中显著高表达，通过敲低YTHDC1发现AML细胞增殖减慢，髓系分化增强，细胞凋亡增多并且显著抑制小鼠中AML的发展。该研究揭示了YTHDC1结合m6A-mRNA通过相分离的方式形成核内凝聚物，保护其靶点基因不被降解，促进基因表达的机制。
1）在AML细胞系中通过shRNA敲低/CRISPR敲除YTHDC1则导致AML细胞增殖减慢，髓系分化增强，细胞凋亡增多。

2）通过CRISPR/Cas9基因敲入为内源性YTHDC1加上EGFP标签，证明YTHDC1蛋白在体内和体外均进行液-液相分离。

3）通过点突变或片段敲除表征YTHDC1中IDR结构域对细胞中LLPS至关重要。

 

ok138cn太阳集团529针对“相分离研究”的相关产品及服务：

1. 基因敲除定制服务：针对客户指定区域（编码区/非编码区）进行大片段/精准/非精准敲除；

2. 可诱导型shRNA敲低稳定细胞系：针对必需基因，我们提供可诱导型敲低稳转细胞系方案；

3. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：基于dTAG精准靶向蛋白降解，实时监控蛋白功能；

4. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：基因原位N端/C端插入EGFP,RFP,Strep-tag等标签；

5. 点突变稳定细胞系构建：针对客户指定基因的氨基酸进行定点突变，构建稳定细胞系。

 

2、相分离参与DNA损伤与修复

研究人员揭示了RAP80介导的BRCA1招募的新机制[4]，为相分离在DNA双链断裂修复中的作用提供了新的见解。RAP80与Lys63连接的多聚泛素链的结合增加了多价相互作用，从而诱导RAP80在DNA损伤位点的液液相分离（LLPS）。同时发现，RAP80 LLPS增强了肿瘤细胞的放疗抵抗性，表明RAP80可能是肿瘤放疗增敏的潜在靶点。

该研究通过CRISPR敲除RAP80证明其在细胞核中形成液态冷凝物,消除RAP80的凝集显著抑制了BRCA1焦点的形成，揭示了RAP80凝集在BRCA1招募和辐射敏感性中的关键作用。

3、相分离调控肿瘤发生
研究发现环状RNA circVAMP3通过促进CAPRIN1蛋白相分离[5]，在细胞内形成应激颗粒（stress granules）以阻止c-Myc mRNA的翻译，进而抑制肝细胞性肝癌（HCC）的发生发展。

1）通过基因编辑在细胞和小鼠中敲低circVAMP3，证明其具有抑制HCC细胞增殖和迁移的作用。

2）研究发现circVAMP3招募CAPRIN1-G3BP1复合物，导致蛋白聚集并发生相分离，在细胞中促进应激颗粒的形成；敲低circVAMP3，应激颗粒减少。

4、相分离与肿瘤免疫
研究发现在IFNγ刺激下，肿瘤细胞中KAT8-IRF1通过形成具有促进转录功能的凝聚体，增强PD-L1表达的分子机制[6]；发现了凝聚体形成可增强KAT8对IRF1乙酰化催化速率；开发了抑制凝聚体形成的阻断多肽，并证明其抗肿瘤活性。
1）研究人员利用全基因组CRISPR-Cas9文库进行筛选，发现乙酰转移酶KAT8可调控PD-L1的表达，并通过基因敲除在细胞中得到验证。

2）通过TurboID邻近标记联合质谱分析，研究人员鉴定到转录因子IRF1与KAT8存在相互作用。

3）在KAT8 N端插入mEGFP，IRF1C端插入mCherry标签，检测二者定位，发现二者共表达在细胞核内可形成液滴状凝聚体。

4）利用dCas9-SunTag-sgARRAY进行基因组定位，研究人员观察到内源KAT8-IRF1凝聚体可定位于PD-L1启动子。

 

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1. 全基因组基因敲除混合pooled文库筛选：通量更大且耗时更少，适用于可因选择性压力而改变的表型，例如细胞活力/增殖测定或FACS分析；

2. 人/鼠源基因敲除阵列arrayed文库筛选：针对19+代谢通路，更高精确性、数据解读简化、实验重复性强、研究需求更广；

3. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：基因原位N端/C端插入EGFP,mCherry等标签，用于共定位研究等；

4. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：基因原位N端/C端插入birID,TurboID等标签用于临近标记检测，可发现蛋白-蛋白互作（弱互作、瞬时互作）；原位插入Strep-tag等用于AP-MS检测，可发现强蛋白-蛋白相互作用；

5. ok138cn太阳集团529strep II纯化填料：针对Strep-tag蛋白以及生物素标记的蛋白进行极高亲和力富集（比抗体富集的亲和力高100倍）。

6. AP-MS/IP-MS检测：针对临近标记或者亲和标记（Strep-tag）的细胞样本进行质谱检测，发现互作蛋白；

7. 基因tagging原位插入稳定细胞系构建：dCas9-SunTag 系统和荧光蛋白，对基因组位点进行活细胞成像分析。

 

三、基因编辑技术在相分离研究中的重要性

在体外细胞水平的基因编辑（敲除/敲入）已经成为相分离研究中的常规技术手段。针对相分离的生物学研究以及在肿瘤方面的研究，起到了关键作用。随着相分离研究的进一步深入，也会催生着基因编辑技术在该领域的进一步的深度整合。

ok138cn太阳集团529作为一家专注于高通量基因编辑工具研发的技术驱动型公司，将持续关注该领域，并推出相关的产品与服务，全面助力科研工作者在相分离研究！

参考文献

[1] Razin, S., Gavrilov, A.The Role of Liquid–Liquid Phase Separation in the Compartmentalization of Cell Nucleus and Spatial Genome Organization. Biochemistry Moscow 85, 643–650 (2020).
[2] Alberti S, Gladfelter A,et al.Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates.Cell. 2019 Jan 24;176(3):419-434.
[3] Cheng Y, Xie W, et al.N6-Methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation. Cancer Cell. 2021 Jul 12;39(7):958-972.e8.
[4] Qin C, Wang YL, et al.RAP80 phase separation at DNA double-strand break promotes BRCA1 recruitment. Nucleic Acids Res. 2023 Oct 13;51(18):9733-9747.
[5] Chen S, Cao X, et al.circVAMP3 Drives CAPRIN1 Phase Separation and Inhibits Hepatocellular Carcinoma by Suppressing c-Myc Translation. Adv Sci (Weinh). 2022 Mar;9(8):e2103817.
[6] Wu Y, Zhou L, et al.Disrupting the phase separation of KAT8-IRF1 diminishes PD-L1 expression and promotes antitumor immunity. Nat Cancer. 2023 Mar;4(3):382-400.
 
 

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